ATCC细胞株建株的要点及基本过程

　　（一）肿瘤细胞培养技术要点

　　1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。

　　2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。

　　排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。

　　3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率

　　根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

　　（二）人类淋巴母细胞建ATCC细胞株方法

　　l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。

　　2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。

　　3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。

　　4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。

　　5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EB（EB病毒）液，混匀。

　　6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。

　　7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。

　　8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l-2次，并维持环胞霉素的浓度。

　　9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1-2ml培养基，37℃培养10-15天，一般每隔3-4天观察一次，决定是否换液，传代。

　　10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。

　　建立什么样的体外培养ATCC细胞株可被认可为己鉴定的细胞？视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需说明组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。细胞生物学检测，了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。培养条件和方法，应说明ATCC细胞株适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。