来自ATCC的细胞培养指南（精简版）

每天对待细胞那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了。如果手里有一份来自机构ATCC的《细胞培养指南》，养细胞可就得心应手多了。下面是细胞培养指南（精简版），值得收藏。

   综述

细胞要么在培养瓶表面贴壁生长（锚定依赖性）要么悬浮生长（非锚定依赖性）。细胞的生长和分裂，通常遵循一个由四个阶段组成的特征性增长模式：停滞期，对数期（指数期），平稳期（平台期）和衰退期。

停滞期——将细胞接种至培养瓶之后，细胞逐步恢复的同时，缓慢生长。

对数期（指数期）——细胞进入一个对数生长的时期，一直持续到整个生长表面被占满或细胞密度超过培养基提供营养的能力。

平稳期——细胞增殖减慢或停止。

衰退期——如果不更换培养基且细胞数量不减少，细胞活力会下降，并出现细胞死亡。

为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。这意味着细胞需要在进入平稳增长阶段之前，或在单层细胞长成100%融合之前，或在悬浮细胞达到推荐的最大细胞密度之前定期进行传代培养。为每个细胞系绘制生长曲线，对于测定该细胞系的生长特性是必要的。

~冻存细胞复苏~

培养一个新的细胞时要特别注意培养基一致性的问题。虽然大多数细胞系可以在不止一种培养基中生长，但是当培养基改变时，细胞的性质也会变化。来自于不同厂家的培养基，即使名字相同或类似，配方也略有差异。仔细阅读说明书，配方，标签，确保使用正确的培养基。

细胞复苏时，应以最快速度融化冻存的细胞溶液，然后迅速与*培养基混合，并接种到合适的细胞瓶中。

复苏程序

1) 准备细胞培养容器（如T-75细胞瓶），加入至少10 ml适当的培养基，并平衡温度及pH。

2) 从液氮罐中取出冻存管，并在37℃（或适合该细胞的温度）水浴中缓慢摇动至冰晶*融化（约2 min），注意解冻过程要迅速。

3) 从水浴中取出冻存管，浸泡或者喷撒酒精消毒。后续的操作，需在无菌操作台中，并保证严格无菌。

4) 拧开冻存管盖，将细胞悬液转移至含有9ml*培养基的无菌离心管中。温和离心(125g×10min)，弃去上清去除冻存保护剂。注意不要扰动细胞层。加入1-2 ml*培养基重悬细胞，缓慢吹打使细胞团变松散。将细胞悬液转移至含培养基的容器中充分混合。

5) 24小时后，检测细胞状态。

细胞传代培养~

单层贴壁细胞的传代培养

为了保证单层贴壁细胞的对数生长，需要定期传代。当细胞生长接近指数生长后期(汇合率大约70%到90%)，准备传代。针对传代过程，ATCC提供的产品说明中，会推荐细胞传代分配比例和补充培养基策略。

单层贴壁细胞传代，需要打断细胞之间的连接。对于比较松散的连接，猛击培养瓶侧壁，可以分离细胞。很多情况下，需要/EDTA的蛋白水解酶来消化。对于一些细胞系，需要采用刮等机械方法分离细胞。细胞分离成为单细胞悬液后，稀释到适当的密度并转移到新的培养瓶中，在适当的生长培养基中，细胞将再贴壁生长和分裂。

由于每种细胞都是的，孵化时间和温度、清洗次数或溶液配方可能会有所不同。分离过程中，应用显微镜密切观察细胞，以防止细胞损伤。这个过程根据容器使用合适的培养体积。

悬浮细胞的传代培养

相对于单层贴壁细胞来说，悬浮细胞的传代更具有优势，单层贴壁细胞需要蛋白水解酶，会造成细胞损伤。而悬浮细胞可以使用稀释的方法来传代，细胞生长没有延迟，对实验室空间要求较小，传代培养是线性放大的。比如细胞可以在发酵罐中培养。

根据细胞类型，悬浮培养接种密度从2×10*4至5×10*5活细胞/ml。收获时细胞密度2×10*6细胞/ml。如果细胞接种密度过低，他们将经历增长延迟阶段，增长非常缓慢甚至*死亡。如果细胞密度过高，细胞可能耗尽培养基中营养，而突

~细胞冻存~

随着细胞被冷冻至冰点以下，悬液中冰晶和溶质的浓度有所增加。如果冷却过程中，胞内水分可以渗出细胞，则可以减少胞内冰晶。通常1℃/min的降温速度可以促进此过程。但是，水分的丧失会导致细胞收缩，当这种收缩达到一定程度，又会导致细胞活性的剧烈下降。冷冻保护剂，如甘油或者二甲基亚砜（DMSO），可以缓解这种效应。细胞冻存的标准程序是在含有冷冻保护剂的培养基中，将细胞缓慢冷冻至–70℃，然后将冻存管转移到液氮中以保持低于–130℃的环境。

有很多方法可以实现1℃/min的降温速度。电脑控制的可编程电子降温系统是好的方式，可以精确保持降温速度。这也是ATCC采用的方法。但这种设备价格较高。比较经济的方式是将冻存管放置于冻存盒中，在低于–70℃的冰箱中冻存24小时。之后再转移至液氮长期储存。

以下程序适用于大多数细胞。冻存培养基的配方请参考细胞说明书。冻存时，细胞应处于指数生长期。

冻存程序

1) 冻存前先检测细胞是否受到细菌、真菌、支原体和病毒的污染。如果确定有污染，应将该细胞销毁。

2) 冻存培养基由*培养基和5%D