1. 绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可.吸去胰酶后,残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞.对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞,连续这样传代,对细胞伤害很大.简单的程序是PBS润洗吸去,胰酶润洗吸去,然后37℃消化.比较难消化的细胞(润洗方法5min还不能消化),这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育.

    2.细胞如何算是消化好了呢?不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了,一般你肉眼观察贴壁细胞层,只要能移动了,多半呈沙壮移动,其实已经可以了,很多人喜欢把细胞消化或者吹打成*分离细胞,这是没有必要的.一般能移动了,说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了,细胞之间的附着也已经消失了,细胞已经独立分布了(虽然没有呈现很广的离散分布).这个时候应该停止消化,不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好,间隙很大,才停止.细胞就是*成单个细胞悬液,之后在贴壁的过程中仍然会聚集,这个是贴壁培养的细胞,尤其是肿瘤细胞的一个特性.如果和标准形态不一致,那可能是自己没消化好导致的,但如果消化方法正确,仍然成片分布,甚至*吹打成单细胞悬液,贴壁后仍然成片分布,这是细胞的特性,是因为贴壁过程中重新聚集了.这个时候你拼了命要去让它均匀分布,你的细胞之后会对你越来越不好.

    3.EDTA的作用.胰酶切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白,而EDTA通过螯合Ca离子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加温和.有的人在胰酶里添加一些EDTA,或者对付特别难消化的细胞,添加多一些EDTA.

    4.PBS洗涤.消化之前用PBS洗涤,是常见的操作,因为血清中含有抑制胰酶的蛋白.对于一些难消化细胞,那么可以配制不含Ca,Mg离子的PBS,因为这些离子也会抑制胰酶的活性.但对于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞,不需要配制如此溶液.