【技术文章】细胞养不好？这些注意事项请收好（三）

1、购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？细胞冷冻管解冻后，为何会有细胞数目太少的情形？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于 –80 ℃ 太久。

研究人员在冷冻细胞培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

2、收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

3、如何选用特殊细胞系培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，选 MEM 做粘附细胞培养，RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养shou选 AIM V（12005）培养基（SFM）。

4、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

5、GlutaMAX-I 是什么？培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定，即使在 121 磅灭菌 20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎*降解。

6、什么培养基中可以省去加酚红？培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

7、为什么目录上说 Hank's 平衡盐溶液 （HBS） 在空气中使用，不需要 CO2 培养箱？HBS 和 Earle's 平衡盐溶液 （EBS） 有什么本质的功能差别？

HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在 Eagles （2.2 g/L） 中比在 Hanks （0.35 g/L） 中高。碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡，以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的 CO2 中，溶液会变碱，Hanks 液在 CO2 培养箱中会变酸。如果希望在 CO2 培养箱中保存组织，需要用 Eagles 液，如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用 Hanks 液就可以了。

8、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么？

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用 EDTA 清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

9、其他注意事项

o 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

o 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

o 大部分添加物和试剂多可以冻融 3 次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。

o 在溶解的一周内使用贮存在 4℃ 冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能开始降解，如果在室温下放置超过 30 分钟，就会变得不稳定。

o 为了保持 CO2 培养箱水盘清洁，需定期 （至少每两周一次） 用无菌蒸馏水或无菌去离子水更换。