本文主要解析了稳定细胞系构建的原理和稳定细胞系建立的流程，及瞬时转染和稳定细胞系构建的区别与。帮助我们选择合适的细胞转染的方法，瞬时转染或稳定转染细胞

　　真核蛋白表达的方式有两种：瞬时转染和稳定转染（稳定细胞系构建）。根据自身真核蛋白表达的目的选择合适的转染方法非常重要。瞬时转染持续时间较短，质粒转染进入细胞，3-4天就会丢失。因此可以得到少量的蛋白。相对于此，稳定抵不住筛选是一个长期的过程，需要足够的耐心和细心。

　　稳定细胞系构建原理

　　真核蛋白表达稳定细胞系建立的原理是，将我们所要的目的基因真核到宿主细胞上，随着细胞的生长繁殖，目的基因可以稳定的表达，在通过抗生素的不断加压筛选，zui终得到构建稳定细胞系的过程。相对于瞬时转染，稳定转染技术持续周期长，细胞整合稳定，能够满足后期对蛋白的大量需求。

　　稳定细胞系构建  实验流程

　　1.细胞培养

　　细胞培养是真核蛋白蛋白实验中的*步，原核利用大肠杆菌，真核蛋白表达是培养哺乳动物细胞，常用的真核蛋白表达细胞有CHO,HEK293细胞，稳定细胞系建立选择CHO细胞。

　　细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快复，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下：

　　1）预先加热水浴锅，温度至37-40℃，并在离心管中准备好10ml培养基

　　2）从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀

　　3）当冻存管内*融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有10ml培养基的离心管中

　　4）离心5min，去除上清，得到沉淀

　　5）用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规培养

　　细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。

　　2.稳定细胞系构建（一）

　　以Lipofectamine转染试剂为例进行先瞬时转染，不同转染试剂参考说明书

　　1）将复苏后常规培养的细胞按照1-3x10^5接种到6孔板中，加入2-4ml的*培养基，混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜

　　2）无菌状态下配置如下溶液：a 用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒

　　b 用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂（血清的存在会影响转染效率，因此要使用无血清培养基转染）

　　3）将ab溶液混合并摇匀，室温下放置30min左右

　　4）细胞培养至80%单层左右，用无血清培养基洗涤细胞2次，每孔加入1ml的无血清培养基，并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向轻摇混匀，二氧化碳培养箱中37℃培养24小时

　　5）将转染液倒出，换为*培养基继续培养

　　3.稳定细胞系建立

　　24-72h加入选择性抗生素进行稳定细胞株筛选，预实验确定抗生素的*浓度，确定抗生素对所选细胞的zui低作用浓度。1）提前一天接种细胞与24孔板中，待第二天长成25%单层为宜，二氧化碳培养箱中37℃过夜培养。

　　2）第二天将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）。

　　3）培养15天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准，一般为400-800ug/ml，筛选细胞时可适当提高浓度

　　4）二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代，使用预实验得到的抗生素浓度的培养基培养。后挑选单克隆，有限稀释法挑取单克隆。有限稀释法：将细胞消化下来做连续的10倍稀释，每稀释一梯度都在9孔板中培养，生长一周左右再次挑取单克隆进行培养，如此反复3次。

　　5）Western blot或ELISA检测蛋白的表达情况，挑取多个单克隆进行表达检测，筛选出表达量zui高的克隆传代保存。

　　zui终筛选出稳定高表达目的基因的细胞株，相对于瞬时转染稳定细胞系构建在后续可以节约大量的时间和成本，是满足活性蛋白大量制备的方法。

　　真核系统蛋白表达的操作较为繁琐，困难，有一定的操作难点，相对原核表达得到的蛋白更具天然活性，同酵母表达相似，可以实现蛋白的各种修饰，只是真核蛋白表达可以实现蛋白的复杂、修饰。在制药，活性因子生产方面有很大应用。